培養基

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培養基(Medium)是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養料,一般都含

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有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。有的培養基還含有抗菌素和色素。

培養基由于配制的原料不同,使用要求不同,而貯存保管方面也稍有不同。一般培養基在受熱、吸潮后,易被細菌污染或分解變質,因此一般培養基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養基(如組織培養基),較長時間的貯存,必須放在2~6℃的冰箱內。由于液體培養基不易長期保管,現在均改制成粉末?! ?

按對培養基成分的了解情況分類

  

天然培養基

指一類利用動、植物或微生物體包括其提取物制成的培養基。如牛肉膏蛋白胨培養基、麥芽汁培養基等?! ?

組合培養基

又稱為合成培養基或綜合培養基,是一類按微生物的營養要求精確設計后用多種高純化試劑配制成的培養基。如葡萄糖銨鹽培養基、淀粉硝酸鹽培養基等?! ?

半組合培養基

指一類主要以化學試劑配制,同時還加有某種或某些天然成分的培養基。例如,馬鈴薯蔗糖培養基?! ?

按培養基外觀的物理狀態進行分類

液體培養基

一類呈液態的培養基。

液體培養基

  

固體培養基

一類外觀呈固態的培養基。根據性質又分為固化培養基、非可逆性固化培養基、天然固態培養基、濾膜?! ?

半固體培養基

指在液體培養基中加入少量的凝固劑而配制成的半固體狀態的培養基?! ?

脫水培養基

又稱預制干燥培養基,指含有除水分外的一切成分的商品培養基?! ?

按培養基對微生物的功能作分類

選擇性培養基:一類根據某微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基,具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優勢菌的功能,廣泛用于菌種篩選等領域。

鑒別培養基:一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產物發生顯色反應的指示劑,從而達到只須用肉眼辨別顏色就能方便的從近似菌落中找出目的菌菌落的培養基。例如,伊紅美藍乳糖培養基(EMB)?! ?

常見培養基

細菌培養

牛肉膏瓊脂培養基

牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,氯化鈉 0.5g,瓊脂 1.5g, 水 100ml

在燒杯內加水100毫升,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉,用蠟筆在燒杯外作上記號后,放在火上加熱。待燒杯內各組分溶解后,加入瓊脂,不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補足失水,用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值到7.2~7.6,分裝在各個試管里,加棉花塞,用高壓蒸汽滅菌30分鐘。

馬鈴薯培養基

取新鮮牛心(除去脂肪和血管)250克,用刀細細剁成肉末后,加入500毫升蒸餾水和5克蛋白胨。在

細菌培養基

燒杯上做好記號,煮沸,轉用文火燉2小時。過濾,濾出的肉末干燥處理,濾液pH值調到7.5左右。每支試管內加入10毫升肉湯和少量碎末狀的干牛心,滅菌,備用。

根瘤菌培養基

葡萄糖 10g 磷酸氫二鉀 0.5g 碳酸鈣 3g 硫酸鎂 0.2g 酵母粉 0.4g 瓊脂 20g 水 1000ml 1%結晶紫溶液 1ml

先把瓊脂加水煮沸溶解,然后分別加入其他組分,攪拌使溶解后,分裝,滅菌,備用?! ?

放線菌培養基

淀粉硝酸鹽培養基(高氏一號培養基)

可溶性淀粉 2.0g 硝酸鉀 0.1g 磷酸氫二鉀 0.05g 氯化鈉 0.05g 硫酸鎂 0.05g 硫酸亞鐵 0.001g 瓊脂 2g 水100ml

先把淀粉放在燒杯里,用5毫升水調成糊狀后,倒入95毫升水,攪勻后加入其他藥品,使它溶解。在燒杯外做好記號,加熱到煮沸時加入瓊脂,不停攪拌,待瓊脂完全溶解后,補足失水。調整pH值到7.2~7.4,分裝后滅菌,備用。

面粉瓊脂培養基

面粉 60g 瓊脂 20g 水1000ml

把面粉用水調成糊狀,加水到500ml,放在文火上煮30分鐘。另取500ml水,放入瓊脂,加熱煮沸到溶解后,把兩液調勻,補充水分,調整pH值到7.4,分裝,滅菌,備用?! ?

微藻培養基

BG-11培養基

NaNO3 1.5g K2HPO4 . 3H2O 0.04g MgSO4.7H2O 0.075g CaCl2 .2H2O 0.036g Citric Acid (檸檬酸 )0.006g Ferric ammonium citrate(檸檬酸鐵銨) 0.006g EDTA (dinatrium-salt) 0.001g Na2CO3 0.02g A5 + Co solution * (A5溶液1000×)1ml Distilled Water (蒸餾水)919ml

SE培養基

NaNO30.25g
K2HPO4 . 3H2O0.075g
MgSO4 . 7H2O0.075g
CaCl2 . 2H2O0.025g
KH2PO40.175g
NaCl0.025
Soil extract40ml
FeCl3.6H2O0.005
Fe—EDTA1ml
A5 solution 1000×1ml
distilled water958ml

Soil Extract(土壤提取液)配置方法

取花園土未施過肥0。5kg置于燒杯或三角瓶中,加入蒸餾水1000毫升,瓶口用透氣塞封口,在水浴中沸水加熱2小時,冷卻數小時,在無菌條件下過濾,取上清液,將滅菌蒸餾水加入上清液至總體積1000毫升。土壤提取液保存在4ºC備用。

Composition of the A5 solution

Add to 100 ml of distilled water:

H3BO3286 mg
MnCl2 . 4H2O181 mg
ZnSO4 . 7H2O22 mg
CuSO4 . 5 H2O7.9 mg
(NH4)6Mo7O24 .4H2O3.9 mg

EDTA-Fe的配置方法:

將EDTA和FeCl3.6H2O分別溶于水和HCl(0.1N),混勻即可。

Na2EDTA1g
distilled water50ml
FeCl3.6H2O81 mg
HCl(0.1N)50ml

Pr培養基

Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions:

working solutiong/1000 mL H2O
NaNO30.25
CaCl2. 2H2O0.025
MgSO4. 7H2O0.075
K2HPO40.075
KH2PO40.175
NaCl0.025
A5 solution1ml
EDTA-Fe1ml
FeCl3 (0.05%)1ml

A5溶液和EDTA-Fe溶液配制方法同上?! ?

真菌培養基

薩市(Sabouraud’s)培養基

蛋白胨 10g 瓊脂 20g 麥芽糖 40g 水1000ml

先把蛋白胨、瓊脂加水后,加熱,不斷攪拌,待瓊脂溶解后,加入40g麥芽糖(或葡萄糖),攪拌,使它溶解,然后分裝,滅菌,備用。

本培養菌是培養許多種類真菌所常用的。

馬鈴薯糖瓊脂培養基

把馬鈴薯洗凈去皮,取200g切成小塊,加水1000ml,煮沸半小時后,補足水分。在濾液中加入10g瓊脂,煮沸溶解后加糖20g(用于培養霉菌的加入蔗糖,用于培養酵母菌的加入葡萄糖),補足水分,分裝,滅菌,備用。

把這培養基的pH值調到7.2~7.4,配方中的糖,如用葡萄糖還可用來培養放線菌和芽孢桿菌。

豆芽汁培養基

黃豆芽 100g 瓊脂15 g 葡萄糖 20g 水1000ml

洗凈黃豆芽,加水煮沸30分鐘。用紗布過濾,濾液中加入瓊脂,加熱溶解后放入糖,攪拌使它溶解,補足水分到1000ml,分裝,滅菌,備用。

把這培養基的pH值調到7.2~7.4,可用來培養細菌和放線菌。

豌豆瓊脂培養基

豌豆 80粒 瓊脂 5g 水 200ml

取80粒干豌豆加水,煮沸1小時,用紗布過濾后,在濾液中加入瓊脂,煮沸到溶解,分裝,滅菌,備用。

瓊脂

  

食用菌菌種培養基

馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基

20%馬鈴薯煮汁 1000ml 蔗糖 20g 瓊脂 18g

把馬鈴薯洗凈去皮后,切成小塊。稱取馬鈴薯小塊200g,加水1000ml,煮沸20分鐘后,過濾。在濾汁中補足水分到1000ml,即成20%馬鈴薯煮汁。在馬鈴薯煮汁中加入瓊脂和蔗糖,煮沸,使它溶解后,補足水分,分裝,滅菌,備用。使用該培養基對pH值要求不嚴格,可以不測定。

綜合馬鈴薯培養基

20%馬鈴薯煮汁 1000 ml 磷酸二氫鉀 3g 硫酸鎂 1.5g 葡萄糖 20g 維生素 10mg 瓊脂 18g

先配制20%馬鈴薯煮汁,方法同上。在煮汁中加入上述各種組分,加熱溶解后補足水分,調整pH值到6。分裝,滅菌,備用。 該培養基用于培養和保存靈芝、平菇、香菇等食用菌菌種?! ?

煙草的培養基

在植物組織培養時,通過調節IAA和CTK的比值能影響愈傷組織分化出根或芽.CTK/IAA高時,愈傷組織分化芽

CTK/IAA低時,分化根;CTK/IAA比例適中維持愈傷組織不分化

愈傷組織誘導培養基制備

以MS培養基母液為基礎,向潔凈鋁鍋中順序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,鐵鹽100×母液20mL ,維生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培養基后,再加入0.5mg.L-1的BA8mL,0.5mg.L-1的NAA8mL.然后加入實際配制培養基體積約2/3-3/4的蒸餾水,加入40g蔗糖后攪拌使其溶化,用0.5mol.L-1的NaOH和0.5 mol.L-1的HCl調整pH值至5.8-6.0.加入14g瓊脂,將鋁鍋置于電爐上,攪拌加熱使瓊脂完全溶化,然后用蒸餾水定容至終體積2L,繼續加熱幾分鐘使之混合均勻后分裝于三角瓶中.

煙草葉片愈傷組織誘導

煙草

取一無菌培養皿,用解剖刀切取1-2片無菌苗葉片置于無菌培養皿中,并用解剖刀將葉片切成2mm2左右的小片,然后將其接種于準備好的培養基上,每瓶接種5小片,一共接種6瓶.接種后的三角置于24條件下黑暗培養1周,然后在同樣溫度下有光照和全黑暗下培養3周直至愈傷組織形成(兩種情況各置3瓶).觀察愈傷組織誘導結果,統計愈傷組織誘導率.

器官分化及植株再生培養

將誘導的愈傷組織按類型分別轉入分化培養基上,置于連續光照,溫度20-22 C條件下培養3周,統計愈傷組織再生植株情況.

愈傷組織誘導的總體情況

煙草愈傷組織誘導培養4周后,愈傷組織基本形成,即排除因生長時間不夠而未形成愈傷的情況.具體情況見表一中所示,6瓶培養物均有愈傷形成,且都未發生污染,但誘導率幾乎各不相同.其中, 在光照條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為60.0℅, 在黑暗條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為46.7%.由于實驗過程中,外植體即煙草葉片取得偏小,接種時可能已有部分外植體的大部分細胞脫水死亡,使整個實驗的愈傷組織誘導率偏低,愈傷塊偏小.  

動物細胞培養基

RPMI1640培養基是一個全營養型培養基,廣泛應用于哺乳動物細胞和雜交瘤細胞的培養,如人骨髓瘤細胞、鼠雜交瘤細胞、人白細胞以及B細胞和T細胞。最初設計用于懸浮細胞培養和人白血病細胞的單層細胞培養?! ?

特殊培養基

選擇性培養基

酵母菌富集培養基

葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化銨0.1% 磷酸二氫鉀0.25% 磷酸氫二鈉0.05% 七水合硫酸鎂0.1% 七水合硫酸鐵0.01% 酵母膏0.05% 孟加拉紅0.003% pH4.5

Ashby無氮培養基

富集好養自生固氮菌

甘露醇1% 磷酸二氫鉀0.02% 七水合硫酸鎂0.02% 氯化鈉0.02% 二水合硫酸鈣0.01% 碳酸鈣0.5%  

鑒別培養基

EMB培養基

常用于鑒別E.coli

蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氫二鉀2g 伊紅Y 0.4g 美藍0.065g 蒸餾水1000g pH7.2

2216E培養基配方

分離海洋微生物的培養基配方

蛋白胨 5g 酵母膏 1g 磷酸高鐵 0.01g 瓊脂 15~20g 陳海水 1000ml 煮沸氫氧化鈉(5%)的溶液調PH值7.6~7.8  

天然細胞培養基——血清

天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期,體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過程復雜、批間差異大,因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清,另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。

血清種類

目前用于組織培養的血清主要是牛血清,培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因:來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的,但并不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基,含有豐富的細胞生長必須的營養成份,具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然,胎牛血清是品質最高的,因為胎牛還未接觸外界,血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。

血清的主要成分

血清樣本

血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已知,但還有一部分尚不清楚,且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等,這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。

血清主要作用

1. 提供基本營養物質:氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質。

2. 提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質激素氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

3. 提供結合蛋白:結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

4. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

5. 對培養中的細胞起到某些保護作用:有一些細胞,如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。這種作用是偶然發現的,現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保護細胞免受機械損傷,特別是在懸浮培養攪拌時,粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子,他們在代謝解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。

血清培養基主要問題

1. 血清的成份可能有幾百種之多,目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚,尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識,這給研究工作帶來許多困難。

2. 血清都是批量生產,各批量之間差異很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保證每批血清的相似性極為困難,從而使實驗的標準化和連續性受到限制。

3. 對大多數細胞,在體內狀態,血清不是它們接觸的生理學液體,只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清,因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態,血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。

4. 血清含一些對細胞產生毒性的物質,如多胺氧化酶,能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長,甚至造成細胞死亡。

5. 動物個體不同,血清產地、批號不同,每批質量差異甚大,其成分不能保持一致。

6. 取材中可能帶入支原體、病毒,對細胞產生潛在影響,可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。

7. 大規模生產中,血清來源越來越困難,價格昂貴,是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。

血清的質量標準

血清質量高低取決于兩方面因素:一是取材對象,二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在指定的出生天數之內,取材過程應嚴格按照操作規程執行,制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求:

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。

2. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3. 證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通過濾膜過濾除菌,保證無菌。

5. 無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染,有些國家要求無細菌噬菌體污染。

6. 對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量,細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素,支持細胞增殖檢查。